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Per la prima volta al mondo, uno studio coordinato dalla Prof.ssa Luisa Guerrini, docente di Biologia Molecolare presso il Dipartimento di Bioscienze dell’Università degli Studi di Milano, ha dimostrato che l’azione teratogena del talidomide agli arti e alle orecchie è dovuta alla degradazione della proteina p63 durante lo sviluppo embrionale.
Lo studio, realizzato in collaborazione con il Tokyo Institute of Technology e della Tokyo Medical University, è stato pubblicato sulla prestigiosa rivista Nature Chemical Biology.
Il talidomide è un farmaco commercializzato per la prima volta in Germania nel 1956, e successivamente in 46 Paesi ad eccezione degli USA: tra il 1957 ed il 1961 fu utilizzato per le nausee gravidiche, grazie anche a una pubblicità che sottolineava la “sicurezza” del prodotto. All’inizio degli anni Sessanta un incremento di neonati con malformazioni degli arti fu correlato con l’assunzione materna di talidomide in gravidanza e nel 1961 furono pubblicati sulla rivista scientifica Lancet dati relativi alla correlazione tra malformazioni e assunzione di talidomide, rendendo pubblici i primi casi di anormalità fetale collegabili al talidomide. Il farmaco venne pertanto ritirato dal commercio nel dicembre del 1961.
Il talidomide fu il primo farmaco riconosciuto come causante malformazioni (teratogeno) per l'uomo. L'esposizione materna nelle quattro-sei settimane dopo il concepimento è stata associata a gravi difetti di riduzione degli arti, malformazioni esofagee, duodenali, renali, anomalie dell'orecchio esterno e gravi difetti cardiaci. Tantissimi neonati morirono subito dopo la nascita, molti nei primi anni di vita per gravi difetti cardiaci e non vi è una stima degli aborti indotti dal talidomide.
In tutti questi anni, numerosi studi sono stati condotti per comprendere il meccanismo alla base della teratogenicità del talidomide ma nessuno è arrivato a conclusioni certe. Lo studio “p63 is a cereblon substrate involved in thalidomide teratogenicity'”, ha invece dimostrato l’azione del talidomide sulla degradazione della proteina p63 durante lo sviluppo embrionale.
La proteina p63 è essenziale durante lo sviluppo embrionale per la formazione degli arti, del palato, della pelle e del cuore. Ben cinque sindromi umane sono dovute a mutazioni nel gene p63 e i pazienti affetti da queste sindromi hanno malformazioni agli arti, al palato, al cuore e alla pelle.
Lo studio è partito dall’osservazione di Luisa Guerrini della similarità nelle malformazioni dei “bambini talidomidici” con quelle dei pazienti affetti da sindromi dovute a mutazioni in p63: l’idea iniziale è stata quindi che il talidomide potesse aver agito durante lo sviluppo embrionale sulla proteina p63.
Utilizzando lo zebrafish come animale modello, lo studio ha dimostrato che il talidomide provoca la degradazione della proteina p63 attraverso la molecola cerebron (CRBN). Il talidomide aumenta l’interazione di p63 con CRBN provocando danni alle pinne (corrispondenti agli arti) e alle vescicole otiche (corrispondenti alle orecchie) inducendo la degradazione della proteina ​​p63. Aumentando sperimentalmente i livelli di p63 negli embrioni di zebra fish trattati con talidomide, si recupera il normale sviluppo delle pinne e della vescicola otica.
La vendita di talidomide è stata nuovamente approvata alla fine degli anni `90 nella maggior parte dei Paesi occidentali data la sua attività anti-tumorale, e sono stati adottati stretti sistemi di controllo al suo impiego, al fine di prevenirne l'esposizione in corso di gravidanza.
“Il disastro del talidomide non è però un caso chiuso – conclude la Prof.ssa Luisa Guerrini - in quanto una seconda ondata di “bambini talidomidici” sono nati a partire dall’anno 2000, specialmente in Brasile, dove il farmaco è largamente utilizzato per la lebbra. Questo studio, tuttavia, sarà sicuramente utile nel dirimere le richieste di indennizzo delle vittime del talidomide, in quanto dimostra che il farmaco non ha nessun effetto a livello del DNA ma solo un effetto transitorio a livello della proteina p63”.

MECCANISMO D'AZIONE

La talidomide induce difetti degli arti
impedendo escrescenza angiogenico
durante la formazione degli arti presto durante la formazione degli arti presto
Christina Therapontos , a, b Lynda Erskine , bErin R. Gardner ,c William D. Figg ,De NeilVargesson a, b, 1,

ASTRATTO ASTRATTO
Il talidomide è un potente teratogeno che induce una serie di difetti di nascita, più comunemente degli arti in via di sviluppo. I meccanismi alla base degli effetti teratogeni della talidomide non sono chiare. Qui mostriamo che la perdita dei vasi sanguigni immaturi è la causa primaria di teratogenesi talidomide-indotta e di fornire una spiegazione per la sua azione a livello biologico delle cellule. metaboliti antiangiogenici ma non antinfiammatori / analoghi della talidomide produrre difetti degli arti pulcino. Sia in vitro che in vivo, escrescenza e il rimodellamento dei vasi sanguigni più maturi è bloccato temporaneamente, mentre di recente formazione, in rapido sviluppo, vasi angiogenici sono persi. Tale perdita nave verifica monte delle variazioni dell'arto morfogenesi e l'espressione genica e, in base ai tempi di applicazione della droga, risultati sia morte embrionale o difetti di sviluppo. Questi risultati spiegare sia i tempi e la relativa specificità tissutale di talidomide embryopathy e avere implicazioni significative per il suo utilizzo come agente terapeutico.
Mezzo secolo fa, talidomide è stata utilizzata per le sue proprietà antiemetici da donne in gravidanza in tutto il mondo. Essa ha causato un aumento dei tassi di natalità aborto spontaneo e ancora e un aumento del 40% della mortalità infantile, e fino a 10.000 bambini di tutto il mondo sono nati con gravi malformazioni degli arti, così come altri difetti congeniti molto meno comuni ( 1 - 7 ). I bambini con tali difetti sono ancora in fase nascono oggi, in particolare in Africa e Sud America, dove la talidomide è ormai sempre più utilizzato nel trattamento della lebbra ( 8 , 9 ). Oltre l'80% dei bambini nati da madri che hanno assunto talidomide aveva difetti degli arti ( 2 , 3 , 5 , 6 ). Questi difetti variavano da assenza degli arti (amelia) o elementi prossimali degli arti (focomelia) alla perdita della
punta del pollice o cifre e sono indotti in una piccola finestra time-sensitive di sviluppo ( 2 , 3 , 6 - 8 ). non sono state stabilite L'esatto meccanismo alla base degli effetti teratogeni della talidomide, la sua relativa arto specificità, e la gamma di difetti indotti.
Il talidomide è sia antinfiammatori e antiangiogenica. I suoi effetti antiangiogenici hanno portato ad esso viene postulato come agente antitumorale e sono anche suggerito come causale nella creazione dell'arto teratogenesi ( 1 , 8 , 10 , 11 ). Tuttavia, se l'effetto antiangiogenica provoca difetti degli arti non è stata né confermata in vivo né è noto il
motivo per cui il sistema vascolare dell'arto sarebbe essere mirata in modo specifico. Altri hanno proposto che il talidomide colpisce lo sviluppo degli arti inducendo cambiamenti nell'espressione genica ( 8 , 12 - 15 ). Anche in questo caso, né il meccanismo con cui il talidomide si rivolge l'espressione genica degli arti preferenzialmente né se tali cambiamenti sono la causa primaria dei difetti degli arti è stata stabilita. Qui mostriamo in modo conclusivo che la perdita dei vasi sanguigni di nuova formazione è la causa primaria della talidomide teratogenesi, e gli arti in via di sviluppo sono particolarmente suscettibili a causa della loro rete di vasi relativamente immaturo, altamente angiogenico. Abbiamo inoltre dimostrato che questi effetti sono correlati alla maggiore perdita fetale e sviluppotime-sensitive azione della talidomide ( 2 , 3 , 6 - 8 ).

RISULTATI E DISCUSSIONE RISULTATI E DISCUSSIONE

Antiangiogenica ma non antinfiammatori metaboliti e Antiangiogenica ma non antinfiammatori metaboliti e analoghi della Talido analoghi della Talidomide indurre difetti degli arti. indurre difetti degli arti.
Talidomide applicato a HH St17-19 embrioni di pollo, quando gli arti stanno cominciando a ormare, induce malformazioni degli arti ( 12 , 16 , 17 ) (Fig. S1 ). Tuttavia, talidomide è una molecola molto complessa, che richiede ripartizione metabolica per realizzare l'attività e formando potenzialmente oltre 100 sottoprodotti ( 1 , 18 ). Le principali funzioni di questi sottoprodotti sono antiinfiammatoria o antiangiogenica ( 1 , 18 ). Per determinare l'esatto meccanismo di embriopatia talidomide, abbiamo studiato l'attività teratogena di specifici metaboliti talidomide e analoghi sintetizzati con effetti biologici diversi ( 1 , 18 - 21 ) ( Fig. S2 A-F ). I farmaci sono stati applicati sulla parte superiore del corpo e liquido amniotico di embrioni HH St17-19, in un simile o inferiore concentrazione relativa alla dose terapeutica di talidomide utilizzata nell'uomo (pulcino = 160-1,280 mg / kg; umana = 700-2,000 mg /kg). Questo metodo di applicazione di droga tratta preferenzialmente l'arto destro, che ci permette di utilizzare l'arto sinistro come controllo. sottoprodotti di idrolisi antinfiammatori ed talidomide [5,6-OH talidomide; 5'OH-talidomide; Acid PG (N acido -phthaloylglutamic)] (18 , 21 - 23 ) non ha avuto effetto sullo sviluppo embrionale o degli arti in qualsiasi concentrazione testata [100-800 mg / ml; 160-1,280 mg / kg (n = 16/16 ciascun esperimento)] ( Fig. S2 G-J ). Tuttavia, CPS49, un analogo tetrafluorinated di talidomide che è chimicamente e strutturalmente correlato a prodotti di degradazione talidomide, indotta difetti gravi degli arti simili a quelli osservati dopo aggiunta di talidomide ( Fig. 1 A e B e Figg. S1 e S2 F ) ( 12 , 16 , 17 ). Aggiunta di CPS49 (100 ug / mL; 160 mg / kg), che
ha potenti effetti antiangiogenici e antitumorali in vitro ( 18 , 20 , 21 , 24 ), difetti indotti a 82% (n = 250/306) di arti anteriori e 10 % (n = 32/306) di arti posteriori ( Fig. 1 E, H, J-L).
Difetti angiogenici si verificano prima della variazione del Limb Morfologia. zione del Limb Morfologia.
Per determinare gli effetti della CPS49 sullo sviluppo della formazione vascolarizzazione dell'arto, la rete vascolare è stata visualizzata con inchiostro indiano ( Fig. 1 C-H). Entro 2 h di trattamento, prima sono state osservate variazioni evidenti arto morfologia, CPS49 costantemente indotto una riduzione del 20% della densità dell'imbarcazione rispetto ai controlli (n = 5)

( Fig. 1 I).

Densità Mezzo continuato a diminuire ed è stato ridotto del 34% (n = 7) e 45% (n = 12) per 3 he 6 h dopo il trattamento, rispettivamente, mentre un'area arto era inalterata o solo lievemente ridotta ( Fig. 1 C, D , F, G e I). Le navi erano visibilmente regrediscono da 6 h trattamento post CPS49, risultante in una regione avascolare ingrandita sul nascere distale ( Fig. 1 D e G). In 24 ore, la densità nave è stata diminuita del 64% e la gemma dell'arto stesso è stato gravemente troncato (n = 12) ( Fig. 1 E, H, e I). Significativamente, altri vasi sanguigni e la struttura di altri tessuti nell'embrione non erano affetti ( Fig. 1 A e B). Gli embrioni che erano vitali al giorno 10 sono state colorate di indagare i modelli arto cartilagine ( Fig. 1 J-L). Trattamento CPS49 ha portato in 4 principali fenotipi troncamento
che ricordano la serie di difetti degli arti visto in talidomide colpiti i bambini:; (36%; la perdita degli arti anteriori completa (amelia 21%), a breve struttura di omero-come Fig. 1 K), un abbreviata omero ulna corta (21%), o un arto gravemente troncato con 2 elementi cartilagine articolare accorciati tra loro (21%) (n = 14) ( Fig. 1 J).
Difetti in vascolare di sviluppo si verificano a monte delle variazioni di morte cellulare, proliferazione, e segnalazione. cellulare, proliferazione, e segnalazione.
Per determinare la sequenza di eventi dopo il trattamento CPS49, abbiamo confrontato l'andamento temporale dei difetti dei vasi degli arti con i cambiamenti nella morte cellulare, la proliferazione, e la segnalazione. La morte cellulare non viene rilevata normalmente in gemme degli arti fino HH ST21 e si limita a regioni specifiche ( 25 ). D'accordo, a HH St17-19, 3 ore di trattamento post-CPS49 quando i cambiamenti sorprendenti nei vasi degli arti
si sono verificati già ( Fig. 1 C e F), la morte delle cellule era rilevabile nel dell'arto ( Fig. 2 A e D). Tuttavia, la morte cellulare è stato attivato nel mesenchima degli arti-nascere da 6 h trattamento post-CPS49 (HH St18-20) (n = 8/8) ( Fig. 2 B ed E), e dopo 24 ore, cellule morte-positivo cellule erano presenti in tutta la risultante arto ceppo (HH ST22) (n = 6/6) (Fig. 2 C e F). La proliferazione cellulare è stato anche inalterata a 3 (n = 3/3) e 6 h (n =6/6) trattamento post-CPS49 ( Fig. 2 Q-S). Pattern di espressione di geni essenziali per arto escrescenza, Fgf8 nel AER e FGF10 nel mesenchima sottostante, sono diminuiti in modo significativo, ma non fino a dopo già si erano verificati cambiamenti al modello del  vaso sanguigno. A 3 h, domini di espressione di entrambi Fgf8 e FGF10 erano identici per controllare arti (n = 5/5 ciascuno) ( Fig. 2 G e J). Con 6 h trattamento post-CPS49, espressione Fgf8 stata leggermente ridotta (n = 3/6) ( Fig. 2 H), mentre l'espressione FGF10 rimasta normale (n = 6/6) ( Fig. 2 K), e 24 h , espressione sia Fgf8 e FGF10 era rilevabile nelle arti (n = 7/7 ciascuna) ( Fig. 2 i e L). In tutte le altre regioni dell'embrione, espressione di entrambi i geni è stata influenzata in tutti i punti temporali ( Fig. S3 E e F ).
Espressione di altri geni critici per il normale sviluppo degli arti sia stato influenzato o alterato, ma solo dopo che già si erano verificati cambiamenti nei vasi sanguigni. Espressione di Bmp4, coinvolti in apoptosi, era normale fino a 6 h, ma ha ridotto a 24 ore (Fig. 2 M e N). L'espressione di HIF-1 α, indotta in risposta all'ipossia, era presente a 6 ore,
ma ha perso in 24 ore di trattamento, suggerendo che la morte delle cellule ectopica e rapida indotta dopo il trattamento CPS49 non è causata da ipossia ( Fig. 2 O e P ), ma piuttosto una mancanza di nutrienti e di accumulo di rifiuti tossici o prodotti che interrompono la segnalazione loop tra la cresta apicale e mesenchima. Espressione di
Tbx5, necessaria per zampa anteriore iniziazione (n = 8/8), è stato rilevato in tutti i tempi (Fig. S3 A ). Al contrario, l'espressione di Shh, coinvolto in patterning cifre (n = 4/4), e Msx1, un indicatore della zona di progresso, era normale fino alle 6 ore, ma ridotta o non rilevabili da 24 ore (n = 8/8 per ogni ) ( Fig. S3 BD ). Così, il primo cambiamento rilevabile nell'arto sviluppo è in vasi sanguigni, con aumento dell'apoptosi e la rottura di espressione
genica che si verificano come conseguenza dell'effetto sui vasi. I nostri risultati suggeriscono che i vasi sanguigni degli arti sono mirati direttamente CPS49, ed è la causa primaria dei difetti degli arti associate.

Fico. 2.
Le variazioni di eventi di segnalazione degli arti si verificano secondaria alla inibizione vascolare. (A-P) embrioni HH ST18 trattati con DMSO o CPS49 e fissi 3 ore, 6 ore, o 24 ore successive e colorate per la morte cellulare (A-F) o per wholemount ibridazione in situ per Fgf8 ...
CPS49 distrugge Angiogenic, vasi immaturi, ma non vasi maturi. asi maturi.
Dato che lo sviluppo di tutta dell'embrione dipende criticamente la formazione di una normale rete vascolare ( 26 ), perché sono membra mirati selettivamente CPS49? Al momento della domanda di droga, contrariamente alle navi per tutto il resto dell'embrione, vasi degli arti sono relativamente immaturi, altamente angiogenica e mancano di cellule muscolari lisce vascolari, un marker di scadenza ( 26 ) ( Fig. S4 ). Abbiamo usato culture anello aortico mouse per verificare se i vasi sanguigni immaturi e maturi rispondono differentemente a CPS49 ( Fig. 3 ). CPS49 (10 mg / ml) è stata aggiunta a colture coltivate per 2 o 5 giorni in vitro (DIV). Dopo 2 DIV, culture contenevano in rapida crescita, i vasi immaturi privi di cellule muscolari lisce, mentre dopo 5 DIV, i vasi erano più stabili e hanno
espresso marcatori di maturità nave, come actina del muscolo liscio ( Fig. 3 A, D, G e J).
Aggiunta di CPS49 per colture coltivate per 2 DIV induce una perdita del 57% di microvasi entro 6 ore ( Fig. 3 B, C, e M e Tabella S1 ). Al contrario, CPS49 avuto alcun effetto sul numero nave in colture coltivate per 5 DIV ( Fig. 3 H, I, K, L e N e Tabella S1 ), che è correlato con precisione con la perdita CPS49 indotta vasi dell'arto immaturi ( Fig . 1 F, G e I), ma non vasi di più maturi nel resto dell'embrione ( Fig. 1 A e B). Tuttavia, i vasi
sanguigni maturi non sono del tutto insensibili alle CPS49. In entrambi i giorni 2 e 5 DIV, conseguenza dei vasi sanguigni sopravvissuti è inibito temporaneamente, con una conseguente significativa riduzione lunghezza della nave per 6 h, seguita dal recupero parziale di 24 ore ( Fig. 3 O). Questo recupero si adatta con precedenti relazioni
suggeriscono CPS49 è attivo in vitro per 12-18 h ( 27 ). Identici risultati sono stati ottenuti utilizzando colture di anelli aortici ratto ( Fig. S5 ). Insieme, questi risultati dimostrano direttamente che blocchi CPS49, temporaneamente, escrescenza distale da tutte le navi e, soprattutto, uccide immaturi, altamente angiogenici ma non vasi più maturi.

Fico. 3.
Obiettivi CPS49 angiogenici dei vasi sanguigni. (A-L) culture mouse ad anello aortico al giorno 2 (A-F) e il giorno 5 (G-L) colorati con IsolectinB4-AlexaFluor488 coniugato ad etichettare le cellule endoteliali (A-C, E-I, K, e L) o anti-alfa-Smooth ...

CPS49 Obiettivi del citoscheletro delle cellule endoteliali Prevenire Filopodial escrescenza e formazione del tubo. escrescenza e formazione del tubo.
Per determinare direttamente l'effetto di CPS49 sulla escrescenza angiogenica e germinazione delle cellule endoteliali, abbiamo usato 2 approcci diversi. In primo luogo, abbiamo trattato transgenici fli1-EGFP zebrafish embrioni transgenici ( 28 ) con CPS49 (15 mg / ml) e, utilizzando time-lapse imaging, analizzato lo sviluppo dei vasi sanguigni intersomitic per un periodo di 3 ore. CPS49 è diminuito in modo significativo il numero di cellulare filopodi punta, strutture ricche di actina essenziali per la migrazione delle cellule endoteliali e escrescenza ( Fig. 4 A-G). La perdita di filopodi era associato ad una drammatica diminuzione della portata di escrescenza nave, con conseguente fallimento per stabilire una rete vascolare normale ( Fig. 4 A-F e H). In secondo luogo, abbiamo
aggiunto CPS49 a colture di cellule da una linea di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). Normalmente queste cellule assemblare rapidamente in tubi ricorda molto da vicino dei vasi sanguigni ( 20 ). Aggiunta di CPS49 (10 mg / ml) per le cellule HUVEC nuova placcato bloccati formazione del tubo completamente ( Fig. 3 P e Q).
Successivamente aggiunta del farmaco per culture in cui tubi già formate non ha influenzato i tubi preesistenti, ma impedito espansione e la crescita ( Fig. 3 R-T). Questi risultati sono in stridente accordo con i nostri risultati delle culture anello aortico ( Fig. 3 e Fig. S5 ), confermando che CPS49 ha diversi effetti sui vasi sanguigni a seconda del loro grado di sviluppo. A livello cellulare, abbiamo scoperto che CPS49 inducono notevoli cambiamenti nella actina e microtubuli citoscheletro entro 1 ora ( Fig. 4 I-L). CPS49 (10 mg / mL) induceva la formazione di fibre di actina stress ( Fig. 4 I e K) e microtubuli depolimerizzazione ( Fig. 4 J e L). Tali cambiamenti sono associati con i cambiamenti nella migrazione cellulare e la proliferazione, rispettivamente ( 11 ). Tutti questi dati nel loro insieme dimostrano che gli obiettivi del CPS49 angiogenico endoteliali actina cellulare e microtubuli citoscheletro, con una conseguente perdita di cellule filopodi punta. In appena generato, vasi instabili questi cambiamenti sono associati con la perdita di navi complete, mentre in vasi, stabili più maturi, la nave preesistente è relativamente inalterata,
ma in grado, temporaneamente, per generare nuova escrescenza ( Fig. 4 M). L'effetto di CPS49 sullo sviluppo del tessuto dipende quindi lo stato del sistema vascolare sottostante. In tessuti come l'arto, con rapida crescita e il rimodellamento, le reti dei vasi immaturi, la perdita nave CPS49 indotta risultati in gravi difetti di sviluppo. Al contrario, in altre regioni embrionali con le reti dei vasi più maturo, stabile, la compromissione temporanea di escrescenza nave non ha un impatto significativo sullo sviluppo normale.

Fico. 4.
CPS49 impedisce estensioni filopodial nelle cellule endoteliali. (-F A) immagini confocale di navi
intersomitic zebrafish (ISV) la formazione di 3 h (A-C) o 6 h (D-F) dopo DMSO (A e D) o CPS49
(B, C, E, e F) Trattamento a 24 ore postfertilization. ...
CPS49 influisce sviluppo embrionale Durante una finestra specifica tempo. estra specifica tempo.
Se il nostro modello è vero, aggiunta di CPS49 nelle fasi precedenti o successive di
sviluppo dovrebbe comportare difetti più o meno gravi, rispettivamente. I nostri risultati
confermano il nostro modello e correla con il periodo di time-sensitive di azione talidomide
in gravidanza ( 1 - 5 ). Applicazione di CPS49 di embrioni HHst13-15 (giorno 2) quando
l'embrione è solo all'inizio per essere vascolarizzato, con altamente angiogenica, vasi
immaturi, si traduce in 100% letalità embrionale entro 12 ore (n = 12/12) ( Fig. S6 ) . Al
contrario, oltre a fasi successive (HHst24-28) generato progressivamente meno gravi
difetti degli arti. A HHst24, CPS49 perdita del solo handplate (n = 6/6) (indotta Fig. 1 M)
rispetto alla maggior parte delle strutture degli arti dopo l'aggiunta al HHst17 ( Fig. 1 J e
K). Al HHst28, gli effetti sono stati anche meno gravi con solo le punte delle cifre 2 e 3
persi (n = 6/6 /) ( Fig. 1 N).
Go to:CONCLUSIONI CONCLUSIONI
Un gran numero di modelli e ipotesi sono state precedentemente pubblicate che cercano
di spiegare la base di difetti degli arti talidomide-indotta ( 8 , 12 - 15 ). Tali modelli
includono cambiamenti nell'espressione genica ( 8 , 12 - 15 ), induzione di stress
ossidativo ( 8 , 14 , 15 ), effetti sul chrondrogenesis ( 8 ), mutazione del DNA ( 8 ),
distalizzazione arto germoglio ( 13 ), e induzione di morte cellulare ( 8 , 12 ). Questi
modelli, anche se interessante, non affrontano obiettivi come talidomide l'arto
preferenzialmente. I nostri dati dimostrano chiaramente che la causa primaria di
malformazioni degli arti talidomide-indotta è la perdita di formatura vascolarizzazione
dell'arto. Di conseguenza, variazioni di morte cellulare e la perdita di vie di segnalazione
gene quindi risultano. Una sfida per il futuro sarà quello di determinare la sequenza di
celle e cambiamenti molecolari dopo l'inibizione vascolare dell'arto. La talidomide può
anche indurre altri difetti al corpo, in particolare per le orecchie, occhi, cuore, rene, e
genitali ( 1 - 8 ). Sia che questi difetti sono causati anche impedendo l'angiogenesi, in un
modo time-sensitive come questi tessuti che formano sono vascolarizzati, resta da
stabilire ed è al centro dei lavori in corso. Una caratteristica sorprendente di talidomide è
che non è teratogeno in alcune specie animali, in particolare il mouse ( 2 , 8 , 29 ).
Tuttavia, i nostri risultati dimostrano chiaramente che i vasi sanguigni del mouse sono
sensibili CPS49 ( Fig. 3 ). Una possibilità è che talidomide non passa attraverso la
placenta mouse. In alternativa, i prodotti antiangiogenici, legati alla CPS49, non vengono
generati in queste specie. Infatti, lavoro precedente ha dimostrato che l'attivazione
metabolica del talidomide è specie dipendenti ( 30 ). Ulteriori studi saranno necessari per
testare questi modelli.
Utilizzando CPS49, un analogo bioattivo di talidomide che è legato a prodotti di
degradazione talidomide, abbiamo risolto un puzzle di 50 anni e ha dimostrato, utilizzando
una serie di in vivo e in sistemi in vitro, che gli effetti differenziali su immaturo e più stabile
reti di vasi sanguigni spiega il embriopatia talidomide visto negli esseri umani. Inoltre, si
descrive la base dell'azione CPS49 sulla cellula endoteliale, dimostrando che escrescenza
filopodial è inibita e le cellule si impedisce la proliferazione e la migrazione e la formazione
di tubi vascolari forniscono una spiegazione per i suoi effetti a livello cellulare. I nostri
risultati spiegano la maggiore perdita fetale, la gamma di anomalie dello sviluppo, e anche
la finestra time-sensitive del farmaco, tutto dipende dallo stato del sistema vascolare al momento della domanda di droga. Inoltre, dimostriamo che nell'arto in via di sviluppo,
talidomide / perdita nave CPS49-indotta è l'innesco primario che porta ad un aumento
della morte cellulare e di valore in vie di segnalazione degli arti, con conseguente
conseguentemente agli arti fallimento escrescenza e troncamenti ( Fig. 4 N). Un restante
puzzle è il meccanismo con cui focomelia (perdita di prossimale ma non elementi distali) si
verifica. Un'ipotesi interessante per come questo si pone in esseri umani è che in alcuni
casi una perdita parziale di FGF signaling è indotta in topi perché questo si traduce in
perdita di elementi prossimali degli arti ( 31 ) ( Fig. 4 N). Tale effetto potrebbe avvenire
attraverso diffuso, diffusa morte cellulare mesenchimali, lasciando una certa funzione di
segnalazione FGF nella cresta apicale, a sua volta permettendo FGFs al distalise dell'arto
ceppo risultante, dopo l'azione del farmaco ha portato fuori ( Fig. 4 N).
Dimostrando che CPS49 colpisce in modo differenziato i vasi sanguigni a seconda del loro
stato di maturità, questo lavoro avrà un impatto significativo sullo sviluppo di talidomide /
CPS49 come trattamento per il cancro della fase iniziale, così come la produzione di una
versione non teratogeno della talidomide mantenendo i benefici terapeutici. Questo lavoro
fornisce anche una piattaforma per studiare lo sviluppo e l'origine di altre malformazioni
degli arti, uno dei difetti congeniti più comuni negli esseri umani ( 32 ).
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MATERIALI E METODI MATERIALI E METODI
Chick Embriologia e analisi. Chick Embriologia e analisi.
Uova pulcino bianco Livorno (forniti da Henry Stewart, Lincolnshire, Regno Unito) sono
state incubate a 37 ° C fino a quando la fase di sviluppo richiesta ( 33 ) e fino a quando le
membrane sono stati rimossi per l'applicazione della droga per l'embrione. analoghi
Talidomide e metaboliti sono stati sciolti in DMSO (Sigma) alla concentrazione di 40 mg /
ml e sono stati diluiti in preriscaldata DMEM (Sigma Aldrich) a 100 mg / ml (CPS49) o 100-
800 mg / ml (5,6-OH talidomide , 5'OH-talidomide, acido PG). Farmaci (100 microlitri) o
solo veicolo (0,1% DMSO) (Sigma Aldrich) sono stati applicati alla metà superiore
dell'embrione, che si trova sul lato sinistro e, a causa della limitata diffusione dei farmaci,
questo lato era normale dopo il trattamento e si concentrano come controllo interno. Gli
embrioni sono stati fissati durante la notte in paraformaldeide al 4% in PBS per wholemount ibridazione in situ, acido tricloroacetico al 5% per la cartilagine colorazione, o
ammaccature fissatore per wholemount colorazione anticorpi.
Per la cartilagine colorazione, gli embrioni sono stati risciacquati in etanolo al 70%, tinto in
0.1% Alcian blu / 1% acido cloridrico / etanolo al 70% per 6 ore, sciacquati la notte in
acido-etanolo, disidratati, e liquidati in salicyclate metile. Wholemount ibridazione in situ o
colorazione anticorpale è stata eseguita come descritto in precedenza ( 26 ). Anti-alfaactina del muscolo liscio (1A4) (Sigma) è stato utilizzato a 1: 1.000, antiphosphohistone
H3 (Millipore) a 1: 100, e AlexaFluor 568 (Invitrogen) a 1: 1.500. Iniezioni di inchiostro per
etichettare il sistema vascolare sono stati effettuati come descritto in precedenza ( 26 ).
densità dei vasi sanguigni è stata misurata utilizzando il software ImageJ per contare il
numero di pixel coperti dalla rete vascolare e normalizzati al controllo controlaterale. La
morte cellulare è stata visualizzata ponendo embrioni con loro membrane rimosse in una
soluzione 1 mg / mL di blu Nilo solfato (Sigma Aldrich) disciolto in acqua e filtrato. Gli
embrioni sono stati lasciati a 37 ° C per 30 min e posti in PBS fresco.
Analisi e la fotografia sono stati eseguiti utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza
Nikon SMZ1500 con una fotocamera digitale Nikon DS-5. Le immagini sono state
preparate utilizzando Adobe Photoshop.
Mouse aortica Anello Assay. Mouse aortica Anello Assay.
Le culture sono stati preparati sulla base del test di thin-prep ratto anello aortico ( 34 ).
Brevemente, anelli aortici sono stati ottenuti cross-sezionamento dell'aorta a intervalli di 1
mm, sciacquati in DMEM, e posti su ghiaccio in terreno fresco. Soluzione di collagene (1,5
mg / mL) è stato preparato su ghiaccio, mescolando: 1 volume (vol) 10x MEM (Invitrogen),
1,5 vol 15,6 mg / mL NaHCO 3, 0.1 vol 1 M NaOH e 7,5 vol 2 mg / mL di ratto collagene
coda, di tipo I (BD Biosciences). Quindici microlitri di soluzione di collagene sono stati
aliquotati nel centro di vetrini sterili 13 mm, formando un disco sottile di 6-7 mm di
diametro. Dopo 15-20 minuti a 37 ° C, un anello aortico è stato trasferito a ogni bolla
collagene e ricoperta con altri 15 ml di soluzione di collagene. Anelli stati orientati in modo
che l'asse di ciascun anello luminale giaceva parallelo al fondo del piatto. Dopo
l'incubazione di 15-20 minuti, ogni vetrino è stato trasferito in un pozzo in un 24-pozzetti e
750 microlitri di 1 ml di mezzo di crescita endoteliale completato con la BulletKit EGM-2
(idrocortisone, hFGF-B, 2 mL; VEGF, 0,5 mL; R3-IGF-1, 0,5 mL acido Abscorbic, 0,5 mL,
eparina, 0,5 mL; FBS, 10 mL; hEGF, 0,5 mL; GA-1000, 0,5 mL) (EGM-2) è stato aggiunto per pozzetto. Le colture sono state incubate a 37 ° C in un umidificata CO 2 incubatore con
terreno cambiamento ogni altro giorno. Il giorno di preparazione dell'anello aortico è stato
preso come giorno 0 della cultura. Mouse anelli aortici sono stati trattati con 10 mg / ml
CPS49 o di un veicolo (0,1% DMSO) il giorno 2 o il giorno 5 della cultura. CPS49 e il
veicolo sono stati preparati in preriscaldata EGM-2, aggiunti alle culture, e incubate per 6 o
24 ore. Alla fine di ciascuna incubazione, le colture sono state fissate e colorate con la
Griffonia simplicifolia isolectin-B4, AlexaFluor 488 coniugato (Molecular Probes # I21411 )
per etichettare le cellule endoteliali e contro Alpha-muscolo liscio anticorpi actina (clone
1A4, monoclonale di topo) (Sigma Aldrich # A2547) per etichettare le cellule muscolari
lisce.
Zebrafish Embriologia e Time- Zebrafish Embriologia e Time-Lapse Imaging. Lapse Imaging. Lapse Imaging.
Pesce Fli1-EGFP sono stati ottenuti dal Zebrafish internazionale Resource Center ( 28 ).
Gli embrioni a 24 ore sono stati dechorionated e trattati con 15 mg / ml CPS49 o 0,5%
DMSO in media acquario. Dopo 3 h, gli embrioni sono stati anestetizzati con 0,05%
MS222 (Tricaine) (Sigma Aldrich) e incorporati nello 0,5% agarosio coperto di tricaine.
visualizzazione diretta dei vasi sanguigni è stata effettuata su una scansione laser
confocale microscopio Leica TCS-NT. Le immagini sono state catturate ogni 5 min a × 63
ingrandimenti a intervalli di 2,5 micron ed elaborati utilizzando Adobe Photoshop. Le
misurazioni della lunghezza della nave e il numero filopodi sono stati eseguiti utilizzando
un'immagine J.
HUVEC cellule endoteliali Cultura. HUVEC cellule endoteliali Cultura.
HUVEC (Lonza # C2517) sono state coltivate in EGM-2 di media con i supplementi piena
crescita (Lonza). Le cellule sono state scongelati, mantenuti, e poste in subcoltura
secondo le istruzioni del fornitore. Il CHEMICON® In Vitro Assay Kit angiogenesi (#
ECM625) è stato utilizzato per valutare la formazione del tubo da parte di cellule
endoteliali in risposta al trattamento CPS49. Le colture cellulari sono state esposte a
concentrazioni crescenti di CPS49 (0, 0,1, 1, 10 o 40 mg / mL). Le cellule sono state
incubate per 18 ore a 37 ° C prima di essere analizzato e fotografato per la formazione di
tubi vascolari. Immagini di cellule vive sono state scattate su un microscopio invertito
coltura cellulare Olympus CKX41 dotato di una fotocamera Olympus U-CMAD3 con sistema di ColorView morbida Imaging. Le immagini sono state elaborate e organizzati in
Adobe Photoshop.
Cella di analisi proliferazione. Cella di analisi proliferazione.
Dopo il trattamento farmacologico, gli embrioni sono stati sezionati in PBS e fissati in 4%
PFA notte a 4 ° C. embrioni sono stati poi messo in soluzione al 30% di saccarosio in PBS
durante la notte e successivamente incorporato in Cryo M da letto (Bright) per
criosezionamento. Blocchi sono stati congelati utilizzando ghiaccio secco e conservati a -
20 ° C per 1 settimana. sezioni Ten-micrometriche sono stati tagliati su un criostato, ha
permesso di aria secca, e conservati a -20 ° C prima della colorazione per rivelare cellule
mitotiche. Le sezioni di tessuto sono stati bloccati nel 10% siero di capra in 0,2% Triton X100 PBS per 90 min a temperatura ambiente, prima di incubazione in anticorpo primario
{anti-fosfo-istone H3 [Ser-10, coniglio policlonale IgG (Upstate)] diluito 1: 100 in soluzione
blocco} notte a 4 ° C. Il giorno seguente, i vetrini sono stati lavati più volte in PBS e
incubate in anticorpo secondario [capra anti-coniglio-Cy3 diluito 1: 500 in 1% di siero di
capra / PBS] per 2 ore a temperatura ambiente e al buio. Al termine dell'incubazione, i
vetrini sono stati lavati in PBS, montato in Vectashield mezzo di montaggio per la
fluorescenza (Vector Laboratories), e analizzati mediante microscopia a fluorescenza. Il
numero di cellule fluorescenti sono state contate per germoglio arto in ogni sezione. L'area
di ogni arto è stato quindi calcolato utilizzando il software ImageJ, e il numero di cellule
proliferanti stato infine determinato per area arto unità.
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